口胎牛血清以及LipofectinMine2000购于GIBCO公司；固相放免定量分析HBsAg试剂盒为北京北免东雅生物技术研究所产品；其余化学试剂均为国产分析纯.
 
　　1.2方法
　　1.2.1寡核苷酸合成所有寡核苷酸的合成均由TaKaRa Biotech Co. Ltd完成. 下划线部分是为便于分子克隆操作而引入的限制性内切酶的识别序列，大写碱基为起始码或终止码.  HBc1: 5′gcgcggtaccATGgacatcgaccctt3′ (KpnI)；HBc2:5′gcgcctcgagTCAggatccacattgaggttccc3′ (XhoI, BamHI)；US: 5′gcccggatccatgacctctcgctccgtg3′(BamHI)；UR: 5′ccccagatctatcgggactcgccatacc3′ (BglII)；DS: 5′gccgagatctgacgcggccacggcg3′ (BglII)；DR: 5′gggcctcgagTTAcagctaatcctcttctgag3′ (XhoI)；cmyc1:  5′gcccggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgTAActcgaggggc3′(BamHI, XhoI)；cmyc2:  5′gggcctcgagTTAcagatcctcttctgagatgagtttttgttcggatccgccc3′(XhoI, BamHI).
　　1.2.2细胞培养HepG2.2.15细胞整合有完整的HBV基因组，能持续转录和翻译HBV基因，产生HBsAg, HBeAg和Dane颗粒，由第四军医大学唐都医院传染科惠赠. 细胞在含有15 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(含有终浓度为200 mg/L的G418)，37℃, 50 mL/L CO2条件下进行培养，2 d换液1次，6 d传代1次.
 
　　1.2.3载体构建本实验构建的载体主要有以下几种. pHBc： 以载体EBOHBV为模板，HBc1和HBc2为引物扩增HBc编码序列. PCR产物经KpnI/XhoI酶切后克隆入pcDNA3.1(-)，构成载体pHBc. ① pHVP22/M： 将合成的cmyc1和cmyc2均调至浓度为0.1 mmol/L，取等体积混匀，于100℃煮沸5 min并缓慢冷却至室温退火形成双链. 双链cmyc片段经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/M. ② pHVP22/F： 质粒pVP22/mycHis2为模板，US/DR为引物扩增VP22编码序列全长及cmyc表位. PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/F. ③ pHVP22/U： BamHI单酶切质粒pHVP22/M并进行脱磷酸化处理. 以pVP22/mycHis2为模板，US/UR为引物扩增VP22编码区上游102 bp的片段，用BamHI/BglII酶切后连入pHVP22/M的BamHI位点. 经鉴定为正向连接形成的质粒命名为pHVP22/U. ④ pHVP22/D： 以pVP22/mycHis2为模板，DS/DR为引物扩增VP22编码区下游102 bp的片段. PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/D.
 
　　1.2.4细胞转染参考GIBCO公司的LipofectinMine2000转染技术手册，将细胞以2×108/L接种于12孔培养板，每孔500 μL, 24 h后进行转染. LipofectinMine 2000 5 μL/孔，DNA为6 μL/孔. 转染分为7组：pHVP22/F, pHVP22/U, pHVP22/D, pHVP22/M, pHBc, pcDNA3.1(-)和空转染组，每组设3个复孔.
 
　　1.2.5转基因表达的检测HepG2.2.15细胞以2×108/L接种于内置有盖玻片的6孔培养板，细胞转染48 h后将细胞置于冰上，吸取上清于-20℃冻存. 用PBS (4℃，pH 8.0)洗涤贴壁细胞，弃去PBS，以20 g/L多聚甲醛和1 g/L Triton固定后于冰上放置30 min. PBS洗涤2次，每次5 min，加入1 mL用10 mL/L BSA/PBS 1∶50稀释的鼠抗HBc抗体(或cmyc抗体)，4℃湿盒过夜. PBS同上洗涤后加1 mL 1∶80稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，PBS再次洗涤后以500 mL/L甘油的PBS封片，荧光显微镜下观察并照相.
 
　　1.2.6抗病毒效应分析为分析转染基因的抗病毒效应，转染HepG2.2.15细胞后留取上清，应用北京北免东雅生物技术研究所的固相放免定量分析HBsAg试剂盒进行上清HBsAg含量的测定. 由第四军医大学西京医院核医学科测定包被珠的放射性计数，以每分钟计数(countings per minute，CPM)表示，利用标准品的CPM值与浓度求出直线回归方程，据此得出各样品浓度.
 
　　1.2.7细胞毒性检测应用MTT比色法测定转染引起的细胞毒性作用. 细胞转染后48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO终止培养，振荡10 min，使结晶物充分溶解. 于酶联免疫检测仪检测A490 nm，记录结果.
 
　　统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 11.0进行单因素方差分析以及LSDt检验. P<0.05认为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1载体构建的鉴定为使HBc的DN突变体发挥更强的抗HBV作用，将VP22融合于HBc的C端，构成载体pHVP22/F. 已有研究表明［

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