作者：刁志宏，张明霞，朱幼芙，何海棠，王战会，陈金军，侯金林
【关键词】  肝炎病毒,乙型；基因重组；真核表达
　　Construction of recombinant vector of HBVP22e gene and its expression in HepG2 cells
　　　【Abstract】 AIM: To construct the recombinant expression vector of pCDNA3.1+HBVP22e and transfect HepG2 cells for the expression of HBVP22e, and to assess its relations to HB. METHODS： HBVP22e cDNA was obtained from plasmid p3.8Ⅱ which carried 1.2 copies HBV (adr subtype) genome by PCR and inserted into universal vector pMD18T for identification of its DNA sequence. The recombinant plasmids were constructed by pCDNA3.1+ and transfected into HepG2 cells via liposom. HBVP22e protein was analyzed by immunohistochemistry and microparticle enzyme immunoassay. RESULTS： Expression vectors of recombinant pCDNA3.1+HBV P22e were successfully constructed and transferred into HepG2 cells. Its expressed steadily in HepG2 cells after cultured over several passages. CONCLUSION： HBVP22e can be expressed in HepG2 cells.
　　【Keywords】 hepatitis B virus; gene recombinant; eukaryote expression
　　【摘要】 目的： 利用pCDNA3.1+真核表达载体，建立了稳定表达乙型肝炎（HBV）P22e的HepG2细胞系，用以研究HBVP22e与乙型肝炎发病机制的关系. 方法： 以含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒为模板，PCR获得HBVP22e cDNA片段，分离插入通用T载体pMD18T中鉴定，然后装入真核表达型载体pCDNA3.1+中，脂质体转染HepG2细胞株，免疫组化鉴定细胞内表达，微粒子免疫检查培养上清中分泌抗原. 结果： 成功构建了真核表达载体pCDNA3.1+ HBVP22e，并转染HepG2细胞，经多次传代培养鉴定，获得稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系. 结论： HBVP22e可在HepG2中表达.
　　【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因重组；真核表达
　　【中图号】 R373.2，  R512.6，  Q768
　　0引言
　　HBV基因组含S，C，P，X 4个基因组［1］, C基因除了编码的核壳蛋白HBcAg外，同时编码的前C蛋白HBeAg［2］，是调节免疫的功能蛋白, 也是病毒高水平复制的标志，与乙型肝炎的发病机制关系最为密切. P22e是HBeAg形成过程中的中间产物，P22e可转运和插入细胞膜、释放入胞质, 也可转运入细胞核［3］. 长期以来对滞留的P222e在感染中的作用不明. 由此我们利用pCDNA3.1+表达载体，建立了稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系，以供进一步研究P22e的生物学功能.
　　1材料和方法
　　1.1材料质粒菌株pCDNA3.1+表达载体Invitrogen公司产品由王战会博士提供. 通用T载体pMD18T为大连宝生物有限公司产品. 含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒由本实验室保存提供. 工程菌株E. coli DH5α由本实验室保存传代. 细胞株HepG2细胞由本实验室保存提供.  根据Genbank公布HBV基因（adr亚型）设计针对HBVP22e基因PCR引物，上游引物Primer C1: 1873~1891 5′ GGAATTCATGTCCAAGCTGTGCCTTGGGT 3′，插入EcoR I酶切位点；Pcrimer C2: 2454~2434 5′ GCTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGA 3′，插入Xbal I酶切位点. 引物合成及克隆产品测序由大连宝生物有限公司公司完成. 主要试剂和工具酶，克隆用限制性内切酶EcoR I，Xbal I，T4 DNA Ligase，胶回收纯化、质粒抽提纯化等试剂均购自大连宝生物有限公司；脂质体转染试剂为LipofectamineTM 2000，InvitrogenTM life公司产品；细胞培养用DMEM培养基与胎牛血清（FCS）为PAA产品；G418为Gbico公司产品；检测HBeAg为Abbott公司微粒子免疫荧光法AxSYM专用试剂盒；HBe Monoclonal Antibody (Mouse)为ViroStat公司产品；免疫组化试剂盒为鼎国公司产品.
　　1.2方法以含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒为模板，以Primer C1，Primer C2为一对引物按常规方法进行PCR，反应条件为: 94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，

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