共35个循环，扩增结束后72℃延伸5 min，电泳观察结果. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，按pMD18T试剂盒说明要求，16℃， pMD18T与HBV P22ecDNA进行连接反应1 h以上，CaCl2法转化E. coli DH5α菌株，经氨苄青霉素抗性及α筛选阳性克隆，经EcoR I，Xbal I双酶切鉴定后送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定. 测序结果用WDNASIS与目的序列进行对比分析. 按常规方法获得pMD18T HBV P22e质粒，EcoR I，Xbal I双酶切后回收短片段，同时用相同的限制性内切酶切割载体pCDNA3.1+并回收长片段；T4 DNA ligation连接靶基因及pCDNA3.1+载体片段，CaCl2法转化E. coli DH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，挑取20个克隆，PCR法及限制性内切酶分析鉴定，阳性克隆再送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定. 测序结果用WDNASIS与目的序列进行对比分析. HepG2细胞使用含100 mL/L FCS的DMEM培养基及加双抗（完全DMEM培养基）在37℃ 50 mL/L CO2条件下培养. 按常规方法获得pCDNA3.1+ HBV P22e质粒后，采用脂质体介导基因转染的方法，按说明书要求：于50 μL无血清DMEM细胞培养液中加入0.8 μg质粒，另50 μL无血清DMEM细胞培养液中加入2.0 μL脂质体，轻轻混匀，室温放置15 min，加入到6孔培养板中用DMEM培养液洗过两次的单层HepG2细胞上，在37℃ 50 mL/L CO2条件下培养8 h后，换用完全DMEM培养基37℃ 50 mL/L CO2培养，48 h后改用终浓度400 mg/L G418的完全DMEM培筛选阳性细胞，阳性克隆再扩增培养以G418以300 mg/L维持，按常规进行传代培养；并设空载体pCDNA3.1+转染作为对照. 取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法(microparticleenzymeimmunoassay, MEIA)上AxSYM检测HBeAg示HBV P22e的表达. 阳性克隆采用免疫组化观察细胞内HBV P22e的表达，免疫细胞组织化学SP法操作过程依说明书进行.
2结果
　　经PCR获得HBVP22e cDNA，重组T载体pMD18T HBV P22e及其经EcoR I，Xbal I双酶切15 g/L琼脂糖电泳结果见图1. pMD18T HBV P22e测序结果，其插入序列经用WDNASIS与目的序列进行对比分析，完全相符合. 重组表达载体pCDNA3.1+ HBV P22e及其经EcoR I，Xbal I双酶切15 g/L琼脂糖电泳结果见图2. pCDNA3.1+ HBV P22e测序结果，其插入序列经用WDNASIS与目的序列进行对比分析，完全相符合. pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法上AxSYM检测HBeAg示HBV P22e的表达(图3)：pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，阳性克隆免疫组化观察细胞内HBV P22e的表达(图4)：HepG2 cells转染 pCDNA3.1+ HBV P22e后，胞内见阳性着色. HepG2 cells转染 pCDNA3.1＋则无.
　　图1PCR获得HBVP22e cDNA及应用限制性内切酶酶切方法对重组载体pMD18THBV P22 e的鉴定结果（略）
　　图2应用限制性内切酶酶切及PCR方法对重组载体pCDNA3.1+ HBV P22e的鉴定结果（略）

　　图3HepG2转染后培养上清中HBeAg表达量A：阳性克隆细胞； B：对照组细胞.（略）
　　图4pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，阳性克隆观察细胞内HBV P22e的表达SABC ×400（略）
　　3讨论
　　人类感染HBV后，可以呈现出急性、慢性病毒性肝炎，或者仅成为带毒而不发病的亚临床状态；HBV的感染也是发生肝硬化和肝癌的常见病因，这多认为与HBV的X基因相关［4］. 但以往也有报道这些均与前C基因编码HBeAg的分子调控与人机体免疫应答相互作用有关，HBeAg还是病毒高水平复制的标志［5］；HBVP22e是HBeAg形成过程中的中间产物，P22e可转运和插入细胞膜、释放入胞浆, 也可转运入细胞核，P22e可能是参与HBV复制调节的分子机制［6］. P22e的后一段序列(AA23-73)与Fas(接收凋亡信号的细胞表面分子)死亡区结合蛋白(FADD)的死亡效应区(DED)有23.5%的同源性，FADD对TNFα敏感而诱导凋亡, 已知有与DED氨基酸同源序列的Ⅱ型单纯疱疹病毒E8蛋白和传染性软疣病毒MC159蛋白, 能抑制Fas抗体(一种促效抗体, agonist antibody)和TNF诱导的细胞凋亡［7］, HBV的P22e蛋白可能也有相同的作用,但迄今未见报告.
　　我们利用真核表达载体pCDNA3.1+，建立了在细胞内稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系，以供进一步研究P22e的生物学功能，为下一步研究其与肝细胞凋亡关系的研究奠定了基础.
　　【参考文献】
　　［1］ 骆抗先. 乙型肝炎―基础与临床［M］. 2版. 北京：人民卫生出版社, 2001：27.
　　［2］ Salffeld J, Pfaff E, Noah M, et al. Antigenic determinants and functional domains in core antigen and e antigen from hepatitis B virus ［J］. J Virol, 1989,63(2):798-808.
　　［3］  骆抗先. 乙型肝炎―基础与临床［M］. 2版. 北京

上一页  [1] [2] [3]  下一页