断进行下去［2］. 而抑制端粒酶就能够抑制细胞的这种分裂作用，从而抑制细胞增生. Riches等［3］曾报道：用端粒酶处理可获得永生的人视网膜色素上皮系（340RPET53）. 如何通过影响端粒酶活性抑制RPE细胞增生是目前研究的热点.
　　端粒酶逆转录酶（telomerase　reverse transcriptase，TERT）作为端粒酶蛋白主要组分，被称为端粒酶活性作用的限速因子［4］. 端粒酶通常在除永生细胞系外的正常组织无活性表达，而TERT则可在正常组织中表达［5］. 鉴于TERT在细胞增生过程中的重要作用，我们利用反义核苷酸技术，通过封闭TERT基因表达而抑制RPE细胞增生，探索PVR基因治疗的新途径.
　　1材料和方法
　　1.1兔眼RPE细胞的培养摘取健康灰色家兔眼球，按常规酶消化法眼杯内收获RPE细胞，加入含200 mL/L新生牛血清的改良Eagle培养液(Dubleccos modified Eagle medium, DMEM)，吹打制成细胞悬液；最后以细胞密度5×104/mL接种于培养瓶中，置37℃，饱和湿度、50 mL/L CO2的培养箱中培养和传代. 取第3代的培养细胞,用博士德公司试剂盒作角蛋白免疫组织化学检测.
　　1.2TERT免疫化学检测RPE细胞取第5代的RPE细胞,以细胞数为5×104个/mL的密度接种于置有玻片的24孔板(500 μL/孔). 37℃，50 mL/L CO2条件下，在含200 mL/L新生牛血清的培养液培养24，48，72 h后，取出长有细胞的玻片用SABC法作TERT免疫组织化学检测：一抗为TERT小鼠抗人(兔、鼠)单克隆抗体(Boster产品)，滴度1∶100，二抗为羊抗鼠生物素化二抗(1∶100).
　　1.3制备寡核苷酸(oligodeoxyribonucletide,ODN)备用原液采用与以TERT mRNA翻译启始密码子为起点的一段序列，与该序列互补的为ASODN，与该序列相同的为SODN,序列分别为：5′GAGCGCGGGTCATTGTGCT3′ (ASODN)，5′AGCACAATGACCCGCGCTC3′(SODN). 由上海百沃斯生物公司采用DNA生物合成仪合成，全硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后冻干粉保存. 临用前再加入DMEM液，稀释成2.5，5和10 μmol/L使用.
　　1.4检测ODN作用下RPE细胞TERT表达取第5代的RPE细胞，以细胞数5×104/mL密度接种于置有玻片的24孔板(500 μL/孔)，常规培养24 h后，吸弃含血清培养液，每孔分别加入500 μL的含有上述3种浓度的ASODN和SODN的DMEM液，及无ODN混合液的空白对照DMEM液. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下孵育12 h后加入含200 mL/L新生牛血清的培养液500 μL/孔，继续培养12 h，取出长有细胞的玻片按前述SABC法作TERT免疫组织化学检测. 结果采用盲法计数，细胞核内呈棕黄染色为阳性标志. 每张培养玻片随机选取四周及中央视野，在显微镜下计数阳性细胞率，其平均值即代表TERT阳性表达率.
　　1.5RPE细胞活性检测MTT试验进行RPE细胞的活性检测. 取第5代RPE细胞，以细胞数为1×105个/mL密度的细胞悬液接种96孔板，100 μL/孔. 常规培养24 h后换以含上述3种浓度(每一浓度6个平行孔)的ASODN和SODN混合液DMEM液，100 μL/孔，分别作为反义组和正义对照组，并各设空白对照. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下孵育12 h后，每孔加入含200 mL/L新生牛血清的培养液100 μL继续培养12 h，然后每孔吸出上清液100 μL再加5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h后，弃去上清液，加入二甲亚砜150 μL，振摇15 min，于酶标仪550 nm波长下测吸光度(A).
　　统计学处理： 数据以x±s表示. 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，所用的统计分析方法为方差分析，多重比较采用LSDt检验.
　　2结果
　　2.1兔RPE细胞培养与免疫组织化学鉴定原代培养的RPE细胞多呈扁型或多角形，细胞浆内富含棕褐色颗粒，传代后色素颗粒消失，细胞形态转为梭形. 角蛋白阳性细胞细胞浆呈棕黄色着色，阳性率几乎达100%.
　　2.2RPE细胞TERT表达TERT免疫组织化学检测显示阳性表达细胞细胞核呈斑块状或点状染色，其中部分染色较淡呈弱阳性表达（图1）.
　　图1兔RPE细胞TERT的阳性表达SABC ×400（略）
　　2.3ASODN对RPE细胞TERT表达的抑制免疫组织化学检测显示5 μmol/L和10 μmol/L的ASODN对TERT的表达有明显的抑制作用，其表达阳性率分别为(28.7±5.8)%，(26.3±6.2)%，而空白对照组TERT的表达阳性率为(37.6±4.6)%，与该对照组比较P<0.01，差异有统计学意义. SODN各浓度组作用下的阳性表达率与空白对照组相近，其差异无统计学意义(P>0.05, 表1).
2.4ASODN对RPE细胞增生活性的抑制作用ASODN 2.5， 5和10 μmol/L浓度组与0 μmol/L浓度组比较，细胞的A值差异有统计学意义. 这提示ASODN对RPE细胞的抑制作用可能具有剂量依赖性. SODN组各浓度与0 μmol/L浓度组比较，差异均无统计学意义(表2).
　　表1ODN作用下RPE细胞的TERT表达（略）
　　表2ODN作用下RPE细胞的增殖（略）
　　3讨论
　　PVR的病理过程实质为RPE在炎性因子等刺激下，移行、增生并有表型转化，分泌胶原，形成增生性的视网膜前膜及下膜. 膜的收缩表现为星形皱褶、弥漫性皱褶、环行或前部收缩，以及“餐巾环”、“晾衣杆”样改变，造成牵拉性视网膜脱离［6-7

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