pCI510, pCI507, pCI444系本室将不同缺失突变的核心蛋白基因克隆入真核表达载体pCIneo中构建而成，其中分别插入了自西安地区患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573 bp）, 60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510 bp）, 羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507 bp）, 同时突变掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444 bp）. 原核表达载体pRSETA为Invitrogin公司产品，中间克隆载体pGEMT easy为Promega公司产品. E. coli JM109由本室保存,BL21为Invitrogin公司产品.
　　1.1.2工具酶及主要试剂DNA快速提取试剂盒购自上海华瞬生物工程公司、高保真PCR 试剂盒、DNA分子量标准、蛋白分子量标准均为大连宝生物工程公司产品，HindⅢ, BamHⅠ, T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒购自Promega公司. 抗His抗体购自Invitrogin公司，二抗及显色试剂购自Sigma公司.
　　1.2方法
　　1.2.1PCR引物设计根据源质粒pCI573, pCI510, pCI507, pCI444中HCV核心蛋白基因起始密码子下游及终止密码子上游核苷酸序列设计了3条引物（上海鼎安生物技术有限公司合成）: 上游引物P1: 5′ GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC 3′, 下游引物： P2: 5′ TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA 3′, P3: 5′ TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG 3′. 在其上游引物引入BamHⅠ酶切位点、下游引物引入HindⅢ酶切位点.
　　1.2.2目的片段的扩增分别以质粒pCI573, pCI510, pCI507, pCI444为模板进行PCR扩增，扩增过程中模板与引物对应如下：pCI573, pCI510为P1, P2； pCI507, pCI444为P1, P3. 循环参数为94℃ 5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 1 min共进行30个循环，最后于72℃延伸10 min. 取5 μL PCR反应液在10 g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析.
　　1.2.3重组质粒的构建及鉴定将4种PCR产物按1：3与中间载体pGEMT easy连接，转化感受态细胞JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ, BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司测序. 测序正确后将中间连接产物pGEMT easy573, pGEMT easy510,  pGEMT easy507, pGEMT easy444用HindⅢ, BamHⅠ双酶切，胶回收酶切产物与经相应双酶切的pRESETA质粒连接. 转化感受态细菌JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ, BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司做序列测定.
　　1.2.4融合蛋白的诱导表达将重组质粒pRSETAC573,  pRSETAC510, pRSETAC507, pRSETAC444转化BL21感受态细菌. 30℃振摇扩增转化细菌，3 h后（A600 nm约为0.6）加IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达,分别于1, 3, 5和7 h后收菌. 12 000 g离心5 min,菌体沉淀重悬于100 μL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液中,于液氮中和42℃反复冻融4次,以最大速度4℃离心10 min,然后分别在上清和沉淀中加入100 μL及200 μL 1×SDSPAGE上样缓冲液，置于-20℃备用.
　　1.2.5SDSPAGE融合蛋白定量及Western blot检测融合蛋白用18％的分离胶SDSPAGE电泳后将蛋白转移到NC膜上，以50 g/L脱脂奶TBST封闭，以小鼠抗His抗体（1∶100）为一抗，生物素标记的抗鼠抗体（1∶500）为二抗进行抗原抗体反应.然后将NC膜浸入含链酶亲和素过氧化物酶（1∶500）的TBST中室温振摇1 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍氨法显色.
2结果
　　2.1表达载体的构建及鉴定亚克隆重组质粒pGEMT easy573, pGEMT easy510,  pGEMT easy507, pGEMT easy444以及终载体pRSETAC573,  pRSETAC510, pRSETAC507, pRSETAC444用HindⅢ, BamHⅠ双酶切后，用琼脂糖凝胶进行电泳分别在约573, 510, 507和444 bp处出现条带，与预期分子量相符（图1）. DNA双向测序证实插入片段序列及读码框均正确，表明质粒构建成功.
　　图1重组质粒的限制性酶切分析（略）
　　2.2融合蛋白的表达与分析经SDSPAGE电泳检测，在Mr约21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现条带，均与预期的目的条带分子量一致. 条带随诱导时间延长颜色加深，经IPTG诱导5 h时目的蛋白量最多. 经薄层扫描测定，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的20%. 表达蛋白大部分以包涵体形式存在于菌体沉淀中，上清中也可见明显蛋白条带（图2）.
　　2.3融合蛋白的Western blot结果显色后Mr约21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现蓝色条带，与预期的所要表达的6×His融合不同缺失突变核蛋白分子量大小相符，表明目的蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达(图3）.
　　图2融合蛋白表达的SDSPAGE分析（略）
　　图3融合蛋白的Western blot分析（略）
　　3讨论
　　近年来，核心蛋白的抗病毒免疫

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