作者：王芳，裘秀春，王立锋，许彦鸣，赵晶，孟艳玲，贾林涛，王成济，范清宇，杨安钢
【关键词】  乳腺癌
    【Abstract】 AIM: To observe the expression and the effect of recombinant antiHER2 ScFv/tBid gene in  the  transfected SKBr3 cell line. METHODS: Recombinant gene of  PE transmembrane domain and tbid was obtained from pcDNAbid plasmid by restriction enzyme digestion, and then  cloned into vector pCMV and the recombinant plasmid pCMVrpb was transfected  into SKBr3 cells. Expression of recombinant plasmid and morphologic changes of SKBr3 cells were detected by immunofluorescent staining. MTT test was used to show how the cells  living status was affected by the gene transfection. RESULTS: The recombinant plasmid was constructed and transfected into SKBr3 cells successfully. The fusion protein was found  in the cytoplasm of transfected SKBr3 cells. MTT test and indirect immunofluorescent staining showed the apoptosis of transfected SKBr3 cells. CONCLUSION: Recombinant proapoptotic protein of tBid can be expressed in transfected SKBr3 cells and the expressed fusion protein can induce apoptosis.
    【Keywords】 Bid;  breast neoplasms;  apoptosis;  ScFv antibody
    【摘要】 目的： 观察构建的重组抗HER2 ScFv /tbid基因在SKBr3细胞中的表达及其对转染的SKBr3细胞的作用.  方法： 用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNAbid质粒，获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因，将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游，转染SKBr3细胞. 间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达，MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 结果： 转染SKBr3细胞后，检测出目的蛋白的表达. MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制. 间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达，并可观察到Cyt c在细胞质中存在， SKBr3细胞出现凋亡.  结论： 重组抗HER2 ScFv /tBid分子可以在转染的SKBr3细胞中表达，并且可抑制转染细胞的生长，诱导细胞发生凋亡.
    0引言
    Bid（BH3 interacting death agonist）是Bcl2（Bcell lymphoma2）家族蛋白，编码区cDNA长588 bp，编码表达产物长度为195个氨基酸，分子质量为22×103. Bid只含有一个BH3结构域（9098 aa的区域），而没有Bcl2家族成员的其他保守区域（如： BH1， BH2， BH4），也没有大部分Bcl2家族成员所具有的C末端疏水的膜锚定区域. Bid分子定位于胞质，能够被caspase8，Granzyme B等剪切活化，去除N末端后，截短的Mr 15×103 片段（truncated Bid，tBid）从细胞质转位到线粒体，使线粒体通透性改变，释放细胞色素c和其他的促凋亡分子调节细胞凋亡［1-2］. 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一.有30%左右的乳腺癌患者HER2特异性高表达，并且HER2表达量越高，肿瘤的恶性程度越高，患者预后也越差［3-4］. 本研究中所构建的靶向重组促调亡分子是以HER2为靶点，旨在研究该重组蛋白对乳腺癌SKBr3细胞的促凋亡作用.
    1材料和方法
    1.1材料DH5α感受态细菌，pCMV空载体，pCMVimmunocaspase6质粒［5］，pcDNA3bid质粒［6-7］，人乳腺癌细胞系SKBr3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；RPMI1640，脂质体Lipofectamine2000TM，新生牛血清及反转录试剂盒（Invitrogen公司）；山羊抗人Bid，兔抗人Cty c多克隆抗体（Santa Cruz公司）； Biotin标记的兔抗山羊IgG, FITC标记的驴抗兔IgG，DAPI，AvidinCy3（Molecular Probes公司）；限制性核酸内切酶HindⅢ, XbaⅠ,  EcoRⅠ, NotⅠ, T4 DNA ligase（TaKaR

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